【干货】qPCR常见问题及解决方案

  对于从事分子生物学研究的实验猿来说,RT-qPCR实验可谓是老生常谈了。看似风平浪静,新宝6官网只需“RNA提取-反转录-荧光定量”这些按部就班的操作,实则险象环生,一丁点的出错都有可能让我们怀疑人生。

  即便如此,在CNS的召唤下我们仍旧一遍遍的重复、重复、再重复。小翊深有体会,为此呕心沥血整理出来常用的SYBR Green染料法RT-qPCR实验的几个常见问题,并给出了可能的原因和解决方案,希望大家能够顺利度过RT-qPCR大关。

  RT-qPCR实验中,大家或多或少会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常和重复性不好等问题,可从以下几个方面对症分析。

  正常的扩增曲线一般呈S型,Ct值最好在20-30之间。异常的扩增曲线包括曲线无平台期、曲线呈锯齿状和Ct值偏大等现象。

  1)模板量低或基因表达丰度低,建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。

  2)qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低,建议通过标准曲线确认扩增效率。

  3)扩增产物过长,建议用三步法程序扩增或通过优化引物,扩增产物长度最好不超过300bp。

  4)体系中可能存在抑制剂影响酶的活性,建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

  1)RNA纯度低,建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。

  可能是扩增程序设置错误,未进行荧光信号搜集,建议重新实验,增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。

  ①Ct>35,熔解曲线℃(一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线°C以上),可能是引物二聚体导致,可进一步优化引物。

  NTC正常,NRC有Ct值,可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒。

  【注】NTC是指将H2O代替模板的阴性对照反应;NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。

  1)加样误差导致,建议移液器定期校准,另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。

  熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性,新宝6登录理想的熔解曲线为单峰,异常的熔解曲线会出现杂峰、双峰、宽峰等可能的情况,下面我们来逐一分析。新宝6登录

  ①引物特异性过差导致非特异性产物扩增,建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。

  ②gDNA污染,可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值,可重新制备模板。

  推测是未加模板,仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。

  可能是熔解程序设置错误,未搜集荧光信号,建议重新实验,增加熔解曲线阶段的信号搜集。

  5.熔解曲线)反应体系污染,结合NTC和NRC结果确认污染情况,建议从水,引物,酶和环境等逐一排除污染。

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